Questão 14
UNICAMP 2023
(UNICAMP - 2023 - 2ª fase)
A varíola dos macacos é uma zoonose transmitida pelo vírus monkeypox, um vírus de DNA de fita dupla. A transmissão ocorre por contato próximo com lesões, fluidos corporais, gotículas respiratórias e materiais contaminados. O diagnóstico da varíola dos macacos é feito por exames moleculares que confirmam a presença do DNA viral em amostras humanas de lesões cutâneas ou mucosas.
(Adaptado de https://bvsms.saude.gov.br/02-6-variola-dos-macacos/. Acesso em 28/8/2022).
a) O exame de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional baseia-se na amplificação do DNA em três etapas sequenciais: desnaturação, anelamento ou hibridização, e extensão ou polimerização. Explique as três etapas do exame de PCR convencional para a detecção do DNA viral.
b) Durante a formação dos vírus da família do monkeypox, duas formas infectantes com o mesmo DNA de fita dupla são produzidas pela célula hospedeira: o vírus maduro intracelular (IMV) e o vírus envelopado extracelular (EEV). A membrana das cisternas do complexo de Golgi faz parte apenas do envoltório do EEV. A figura ao lado apresenta os resultados de um experimento de infecção de células em que foi adicionado o mesmo número de partículas virais, e foi analisada a porcentagem de entrada, em função do tempo, das formas IMV e EEV. Considerando os dados apresentados, indique a forma viral com maior capacidade de infecção. Justifique a sua resposta. Cite um mecanismo de liberação para cada forma viral da célula hospedeira.
Gabarito:
Resolução:
a) As três etapas do exame de PCR convencional para a detecção do DNA viral são :
Desnaturação: Este passo é o primeiro evento regular dos ciclos e consiste em aquecer a câmara de reação a 94–98 °C por 20 a 30 segundos. Isso faz com que a fusão do DNA, ou a desnaturação, do modelo de DNA de cadeia dupla rompa as ligações de hidrogênio entre bases complementares, produzindo duas moléculas de DNA de cadeia simples.
Anelamento : Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
Extensão ou polimerização : Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os primers, sintetizando novas fitas de DNA. Este ciclo se repete 25 a 35 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente ocorre em 2 a 4 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.
b)A forma viral com maior capacidade de infecção é o vírus envelopado extracelular pois apresenta maior porcentagem de entrada na celula pelo grafico apresentado. Isso ocorre pois possuir uma membrana permite a entrada por fusão com a membrana plasmatica da celula hospedeira. Um mecanismo de liberação para a forma do vírus envelopado extracelular é a de secreção mediada pelas vesiculas do complexo de golgi, já o virus maduro intracelular a liberação ocorreria por lise celular.